茶樹（Camellia sinensis）是山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）的一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的多年生木本植物，我國(guó)是世界上最大的茶葉生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，國(guó)內(nèi)茶樹種植主要分布在南部20多個(gè)省。其中，福建是我國(guó)重要的產(chǎn)茶大省，2020年福建茶園面積為22.93萬(wàn)公頃，茶產(chǎn)量46.14萬(wàn)噸，綜合產(chǎn)值達(dá)1 300億元。隨著茶樹種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大，茶樹上病蟲害的發(fā)生和危害也逐漸增多，給茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)造成了不同程度的影響。病毒病是近年來(lái)茶樹上新報(bào)道的一種病害，為防止病毒病的進(jìn)一步擴(kuò)散和蔓延，加強(qiáng)茶樹病毒種類、分布及快速檢測(cè)技術(shù)研究具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
近期，福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所聯(lián)合福州海關(guān)技術(shù)中心/福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、榕城海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心完成的題為“福建省茶樹病毒種類鑒定及多重PCR檢測(cè)技術(shù)的建立”的研究在《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)》2024年第57卷4期正式發(fā)表。
2019-2023年，從福建省福州、南平、寧德、泉州、漳州、廈門、三明、莆田和龍巖9個(gè)地市區(qū)采集具有褪綠、皺縮和壞死等疑似病毒感染癥狀的茶樹樣品1 869份，采用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合PCR和RT-PCR檢測(cè)的方法對(duì)茶樹病毒病的病原進(jìn)行鑒定，并將PCR擴(kuò)增獲得的特異性目的片段進(jìn)行克隆和測(cè)序，對(duì)獲得的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析;同時(shí)，根據(jù)GenBank上已報(bào)道的病毒序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)退火溫度、引物濃度、循環(huán)數(shù)等反應(yīng)條件和反應(yīng)程序的優(yōu)化，建立同時(shí)檢測(cè)福建茶樹主要病毒的多重PCR檢測(cè)技術(shù)，并測(cè)定該技術(shù)的特異性、靈敏度及實(shí)際應(yīng)用效果。
茶樹病毒病主要癥狀
從所采集的茶樹病樣上檢出3種病毒，按檢出率從高到低依次為油茶雙生病毒（oil tea associated geminivirus，OTaGV）（48.90%）、茶樹壞死環(huán)斑病毒（tea plant necrotic ring blotch virus，TPNRBV）（26.75%）和茶樹潛隱病毒1（camellia cryptic virus 1，CCV1）（17.98%）;在檢出病毒的1 258份樣品中，有807份為OTaGV、TPNRBV或CCV1單獨(dú)侵染，檢出率分別為37.20%、21.38%和5.56%;其余451份樣品為2種或3種病毒復(fù)合侵染，復(fù)合侵染檢出率達(dá)35.85%，OTaGV+CCV1、TPNRBV+CCV1、TPNRBV+OTaGV、OTaGV+CCV1+TPNRBV 4種類型復(fù)合侵染檢出率分別為17.49%、0.40%、14.71%、3.26%。
在地理分布上，OTaGV在福州、南平、寧德、泉州、漳州、廈門、三明、莆田和龍巖9個(gè)地區(qū)均有分布，其中漳州OTaGV檢出率最高，為96.77%;CCV1在福州、南平、寧德、泉州、漳州、三明、莆田和龍巖8個(gè)地區(qū)均有分布，其中三明CCV1檢出率最高，為66.00%;TPNRBV在福州、南平、寧德、泉州和漳州5個(gè)地區(qū)均有分布，其中泉州TPNRBV檢出率最高，為79.13%;在福建省9個(gè)地區(qū)中，廈門地區(qū)僅檢出OTaGV，三明、莆田和龍巖地區(qū)檢出OTaGV和CCV1，其他5個(gè)地區(qū)同時(shí)檢出OTaGV、TPNRBV和CCV1;福州、南平、寧德、泉州、漳州、三明、莆田7個(gè)地區(qū)檢測(cè)到病毒復(fù)合侵染，其中漳州地區(qū)病毒復(fù)合侵染檢出率最高（85.00%）、寧德地區(qū)病毒復(fù)合侵染檢出率最低（23.03%）。
利用測(cè)定的CCV1和TPNRBV部分基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明本研究獲得的CCV1分離物（FW）與已報(bào)道的福建分離物FJ-SH104（GenBank登錄號(hào)：ON807095）親緣關(guān)系最近、TPNRBV分離物（FU）與福建分離物QZHA92（GenBank登錄號(hào)：OQ948454）親緣關(guān)系最近。經(jīng)優(yōu)化建立的多重PCR檢測(cè)技術(shù)特異性強(qiáng)，僅OTaGV、TPNRBV和CCV1能擴(kuò)增出特異性目的片段，而其他病毒及健康茶樹樣品上均未擴(kuò)增出特異性目的片段;多重PCR靈敏度最低可以檢測(cè)到稀釋至10-4倍的OTaGV、TPNRBV和10-3倍的CCV1;利用該多重PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)茶園中采集的60份病樣進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與單一PCR檢測(cè)結(jié)果完全相符。
多重PCR靈敏度
OTaGV、TPNRBV和CCV1是當(dāng)前福建茶樹上主要病毒種類，其中OTaGV為福建地區(qū)首次報(bào)道，該病毒可侵染茶樹也為首次發(fā)現(xiàn);在檢出的3種病毒中，以O(shè)TaGV發(fā)生分布范圍最廣，其次為CCV1、TPNRBV;福建地區(qū)茶樹病毒目前仍以單獨(dú)侵染為主，但同時(shí)存在較多的復(fù)合侵染，復(fù)合侵染類型包括TPNRBV+CCV1、TPNRBV+OTaGV、CCV1+OTaGV和OTaGV+CCV1+TPNRBV;建立的多重PCR檢測(cè)技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高，可用于茶園茶樹上OTaGV、CCV1和TPNRBV 3種病毒的快速檢測(cè)。研究結(jié)果可為福建茶樹病毒病的綜合防控提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
該研究獲得福建省農(nóng)業(yè)引導(dǎo)性（重點(diǎn)）項(xiàng)目（2020N0024）、福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（FJKF2019-03）的資助。
論文鏈接：
《福建省茶樹病毒種類鑒定及多重PCR檢測(cè)技術(shù)的建立》
引用本文：
陳細(xì)紅, 蔡偉, 虞赟, 李敏, 王念武, 杜振國(guó), 沈建國(guó), 高芳鑾. 福建省茶樹病毒種類鑒定及多重PCR檢測(cè)技術(shù)的建立[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2024, 57(4): 698-710.
CHEN XiHong, CAI Wei, YU Yun, LI Min, WANG NianWu, DU ZhenGuo, SHEN JianGuo, GAO FangLuan. Identification of Tea Plant Viruses in Fujian Province and Establishment of Multiplex PCR Detection Assay[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2024, 57(4): 698-710.
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